β-Mercaptoethanol 蛋白質(zhì)電泳 是一種有機(jī)化合物，其化學(xué)式為HOCH2CH2SH，英文通用縮寫(xiě)為ME或βME。
它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能團(tuán)，為揮發(fā)性液體，具有較強(qiáng)烈的刺激性氣味。
βME通常用于二硫鍵的還原，可以作為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的抗氧化劑。它被廣泛使用的原因是其具有的羥基使它能夠溶解于水中，并且降低它的揮發(fā)性。
蛋白級(jí)(Protein Grade)產(chǎn)品及特點(diǎn):
本產(chǎn)品用于將蛋白質(zhì)的二硫鍵剪切成巰醇的溫和的還原劑。也稱為β- 巰基乙醇或BME。
經(jīng)常加入到酶溶液中來(lái)防止由于半胱氨酸巰基氧化/ 二硫鍵形成造成的催化位點(diǎn)失活；經(jīng)常作為添加的保護(hù)劑使用，終濃度為5 及20mM，含不含EDTA 均可。
操作步驟
（一）獲得目的基因
1、通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體
1、β- 巰基乙醇，蛋白級(jí)(Protein Grade)載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
（三） 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
（四）誘導(dǎo)表達(dá)
1、 β- 巰基乙醇，蛋白級(jí)(Protein Grade)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋過(guò)夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大約需3hr）。
3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
問(wèn)題:蛋白質(zhì)緩沖液中，使用β-Mercaptoethanol 或DTT的效果有什么不同？
β-巰基乙醇和DTT都是還原劑，防止蛋白質(zhì)被氧化，β-巰基乙醇常用濃度為5-20MMOL/L，DTT為0.5-1MMOL/L。因?yàn)?beta;-巰基乙醇加入緩沖液后24小時(shí)易被氧化，
其后加速蛋白質(zhì)的失活，而DTT氧化后形成穩(wěn)定的分子內(nèi)二硫健，并不危及蛋白的巰基，所以在蛋白制備中常用β-巰基乙醇，而長(zhǎng)期儲(chǔ)存用DTT。
還有其上提到的試劑濃度均指終濃度。
問(wèn)題:蛋白loading buffer中的belta 巰基乙醇會(huì)揮發(fā)?
是的，一般來(lái)說(shuō)，loading buffer都是室溫保存的，但其實(shí)β-Mercaptoethanol有很大揮發(fā)性，應(yīng)當(dāng)現(xiàn)用現(xiàn)配，就算是室溫保存，
也不應(yīng)當(dāng)超過(guò)30天，超過(guò)30天后應(yīng)當(dāng)再補(bǔ)充β-Mercaptoethanol
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